Электронная микроскопия и электронная микроскопика

В ИОХ РАН действует единственный в России центр по изучению органических и гибридных систем методом электронной микроскопии. Центр сформирован при поддержке Минобрнауки и научно-методической поддержке Российской академии наук.

Руководитель центра — акад. РАН В.П. Анаников (AnanikovLab.ru, Telegram)

Центр электронной микроскопии проводит совместные исследования с научно-образовательными организациями, проводит семинары и ведет обучающие программы. На базе Центра на современном мировом уровне выполняются дипломные работы студентов и кандидатские работы аспирантов.

Научные работы Центра электронной микроскопии опубликованы в ведущих мировых журналах Nature Reviews Chemistry, Nature Communications, JACS Au, Angewandte Chemie, J. Am. Chem. Soc., Chemical Science.

Применение электронной микроскопии в органической химии — интервью академика-секретаря ОХНМ РАН акад. М.П. Егорова и акад. В.П. Ананикова.

Оборудование — оборудование для исследований методом электронной микроскопии.

Примеры научных статей — некоторые научные публикации, выполненные с использованием методик и оборудования Центра электронной микроскопии ИОХ РАН.

Библиографическое описание:

Просвечивающие микроскопы: принцип работы и преимущества. — Текст : непосредственный // Молодой ученый. — 2018. — № 1 (187). — URL: https://moluch.ru/archive/187/76456/ (дата обращения: 08.06.2023).

Просвечивающий микроскоп был разработан в 50-х годах 20 столетия. Вместо света в просвечивающем электронном микроскопе используется сфокусированный электронный луч, который направляется через образец для формирования изображения. По сравнению с оптическими микроскопами преимущество просвечивающих микроскопов заключается в том, что они могут производить более высокое увеличение и отображать детали, которые не могут быть получены с помощью оптических приборов.

Просвечивающие микроскопы используются для визуализации биологических образцов с максимальным разрешением 0,1–0,2 нанометра (нм). Хотя ни один микроскоп не является «идеальным» для каждой отдельной лабораторной задачи, просвечивающие микроскопы обладают множеством особых преимуществ. Эти устройства исключительно полезны для визуализации тонких срезов образцов и демонстрации тонкостей его ультраструктуры. В данной статье подробнее о том, где применяются просвечивающие микроскопы и их основных преимуществах.

Просвечивающие микроскопы работают аналогично оптическим, но в них используются электронные лучи вместо света или фотонов. Электронная пушка – это источник электронов, и ее функция аналогична источнику света в оптическом микроскопе. Отрицательно заряженные электроны притягиваются к аноду, который представляет собой положительно заряженное кольцевое устройство. Когда электроны проходят через вакуум внутри микроскопа, магнитная линза фокусирует поток электронов. Эти сфокусированные электроны попадают на образец на предметный столик и отражаются от образца, генерируя рентгеновские лучи. Отраженные или рассеянные электроны и рентгеновские лучи преобразуются в сигналы, которые передают изображение на экран, где ученый исследует образец.

Преимущества просвечивающих микроскопов.

Просвечивающие микроскопы считаются идеальными устройствами для визуализации. Технология позволяет рассмотреть молекулы и вирусы. Вирионы или целые вирусы обычно имеют размер от 20 до 300 нм, хотя некоторые гигантские штаммы вирусов могут иметь длину до 1400 нм. Из-за возможности высокого разрешения устройства становятся возможны жизненно важные визуализации новых клеточных органелл и ассоциаций между ними. В медицине они показывают динамику, которая происходит между человеческими клетками, бактериями, паразитами и вирусами. Например, именно трансмиссионная микроскопия позволяет лучше понять развитие форм малярийного паразита и то, как именно он взаимодействует с нашими клетками. Как выглядят вирусы, и как они взаимодействуют с поверхностными клетками.

Криотрансмиссионная микроскопия – это отрасль просвечивающей электронной микроскопии, которая имеет большое значение в структурной биологии, поскольку не требует фиксации или окрашивания для правильного изображения образца. Это выгодно, так как позволяет визуализировать образец в его естественной среде, что в противном случае невозможно в стандартных препаратах для просвечивающего электронного микроскопа.

И наконец, ключевым преимуществом технологии просвечивающего электронного микроскопа является наличие методов, которые позволяют визуализировать внутренние структуры. Таким образом, этот метод в сочетании с электронной микроскопией имеет большое значение для понимания содержания липидов, белков и углеводов в клеточной мембране. 

Сегодня просвечивающие микроскопы стали необходимостью для изучения биологических и молекулярных ультраструктур, некоторые университеты сотрудничают, чтобы иметь доступ к этому оборудованию. Абсолютная детализация и точность изображения, которые стали возможны с помощью этих микроскопов, делают их уникальным продуктом в арсенале структурных и молекулярных биологов.

Основные термины (генерируются автоматически): микроскоп, просвечивающий электронный микроскоп.

В данной работе проводится анализ подбора режима работы сканирующего (растрового) электронного микроскопа в исследованиях биологических образцов: эритроцитов крови в норме и патологии для формирования новых подходов в методах изучения и диагностики заболеваний. Рассматриваются изображения эритроцитов крови пациентов с заболеваниями почек с гематурией, которые в настоящее время диагностируются методом биопсии. Приводится описание подготовки образцов, сравнение режимов работы в исследованиях морфологии эритроцитов. Получены условия проведения эксперимента для повышения качества изображений, позволяющие получить достоверную информацию о морфологии эритроцитов. Результаты исследования могут лечь в основу рекомендаций проведения экспериментов с биологическими образцами человека для формирования новых подходов в методах клинической лабораторной диагностики.

Ключевые слова: электронная микроскопия, лабораторная диагностика, гематурия, гломерулонефрит, морфология эритроцитов, сканирующий электронный микроскоп, качество изображения.

В ходе изучения образцов крови пациентов проводилась экспериментальная работа по выявлению условий проведения исследования, связанной с подготовкой биообразцов и режима работы электронного микроскопа. Очевидно, что при правильном выборе условий проведения экспериментов получались наиболее качественные изображения, которые позволяли делать анализ морфологии эритроцитов крови на нанометровом уровне. Возможно, исследование особенностей морфологии эритроцитов методом СЭМ у пациентов с различными видами гломерулонефритов позволит сформировать новые подходы в их дифференциальной диагностике. Учитывая необходимость обработки при этом большого количества данных и связанные с этим проблемы их оптимального использования существует необходимость разработки метода машинного обучения в исследованиях форм и размеров эритроцитов, НО СЭМ-изображений. Автоматизация распознавания образов эритроцитов и НО существенно облегчит анализ морфологических данных образцов крови и будет способствовать формированию подходов в разработке методов дифференциальной диагностики заболеваний почек. Для машинного анализа морфологических данных образцов крови необходимо проводить подготовительные работы по оконтуриванию эритроцитов (рис. 1). Качество таких работ, в свою очередь, зависит от качества СЭМ-изображений.

Рис. 1. Оконтуривание эритроцитов, увеличенных в 1000 раз с помощью программы Anaconda prompt (Anaconda 3)

Таким образом, целью данной работы является анализ полученных СЭМ-изображений для установления оптимального режима проведения экспериментов на СЭМ образцов крови человека для выработки практических рекомендаций.

Материалы иметоды исследования

Результаты и анализ исследования

На рис. 2 представлены изображения эритроцитов и их поверхности с большим количеством нанообъектов пациента с диагнозом ХМПГН в июне 2019 г. при различных увеличениях. Данные этого эксперимента показали, что края выбранного эритроцита неровные и его поверхность при увеличении более чем 10 000 раз не гладкая и имеет включения в виде ямок, впадин и светлых нанометровых объектов (НО). Размер НО на поверхности эритроцитов варьируется от 30 нм до 100 нм. На основе рис.2 было выявлено, что наибольшее количество НО имеет размер 50–70 нм. Данные снимки были сделаны при следующем режиме работы СЭМ: 1) ускоряющее напряжение равнялось 1,00 кВ; 2) рабочее расстояние — WD равнялось 4,0 мм.

Рис. 2. СЭМ-изображения капиллярной крови пациента с ХМПГН: 1) эритроцитов — а) и б) при увеличениях 1000х и 10 000х соответственно; 2) НЧ — в) и г) при увеличениях 20 000х и 40 000х соответственно.

На рис. 3 представлены эритроциты и НО на их поверхности образца крови пациентки с ХМПГН, забор которого был сделан в декабре 2019 г. Данные снимки были сделаны при следующем режиме работы СЭМ: 1) ускоряющее напряжение равнялось 1,00 кВ; 2) рабочее расстояние (фокусное расстояние) — WD равнялось 3,9 мм. Изменение WD позволило получить снимок при увеличении 80 000 раз, что было невозможно при WD равном 4,00 мм.

Рис.3. СЭМ-изображения капиллярной крови пациента с ХМПГН: 1) эритроцитов — а) и б) при увеличениях 1000х и 10 000х соответственно; 2) НЧ — в) и г) при увеличениях 22 000х и 80 000х соответственно.

Рис. 4. СЭМ-изображения контрольного образца капиллярной крови: 1) эритроцитов — а) и б) при увеличениях 1000х и 10 000х соответственно; 2) НО — в) и г) при увеличениях 20 000х и 40 000х соответственно.

На рис. 5 показаны изображения эритроцитов при одинаковом увеличении и ускоряющем напряжении, но при различных значениях фокусного расстояния.

Рис.5. СЭМ-изображения капиллярной крови пациента с ХМПГН: 1) эритроцитов — а), б), в), г) при увеличениях 10 000х и , , соответственно

Необходимо отметить, что сравнение СЭМ-изображений при равных режимах работы кроме изменения рабочего расстояния WD показывает, что изображения поверхности эритроцитов заметно отличаются. Видно, что небольшое отклонение в 0,1 мм для WD приводит к получению разной информации от изображений. Например, из рис. 4 в) и с) видно, что, когда , видимо, изображение НО размывается из-за отклонения от оптимальной фокусировки в данных исследованиях. И вместо НО с достаточно выраженными формами в виде круглых фигур получаются изображения НО с размытыми контурами. А наиболее оптимальным условием для рабочего расстояния при низком ускоряющем напряжении 1 кВ является, когда (рис.5 б), хотя при увеличении в 10 000 раз при и нет существенной разницы в качестве изображения, но 80 000 увеличение возможно только для без потери качества изображения для НО на поверхности эритроцитов. Еще раз необходимо отметить, что при условии есть возможность получить изображения НО при увеличении в 80 000 раз. И в то же время из рис. 3 г) видно, что при поверхность эритроцитов уже при 1 000 увеличении кажутся идеально гладкими, ровными и на них не видно никаких НО.

На рис. 6 представлена обработка изображения рис. 3 в). Видно, что после обработки четко выделены НО, черным цветом, относительно всего фона. Как видно из рисунка, после обработки ямки на исходном изображении выделяются черными точками с очень малым размером. В дальнейшем возможно произвести фильтрацию для удаления мелких шумовых объектов. Благодаря выделению в дальнейшем можно произвести подсчет количества НО и их сортировку по размерам.

Рис. 6. Снимки до обработки a) и после обработки б) СЭМ изображения при WD=3,9 мм

На рис. 7 представлена обработка изображения рис. 4 в). Изначально видно, что на снимке имеются хлопьевидные объекты на поверхности эритроцита. Но при обработке из-за плохого качества снимка некоторые объекты не выделятся программой. Особенно это видно по краям эритроцита. Конечно, процент потерь не велик. Но также появляются объекты, которые невозможно считать НО, проколы и ямки. При обработке эти объекты закрашиваются черным с размером сопоставимым с НО, что недопустимо.

Рис. 7. Снимки до обработки а) и после обработки б) СЭМ изображения при WD=3,7 мм

Эти два изображения получены при увеличениях примерно в 20 000 раз. На рис. 8 представлена обработка изображения при увеличении в 80 000 раз. Видно, что при таком изображении намного четче выделяются НО и шумы изображений почти исчезают из-за больших отличий в размерах.

Рис. 8. Снимки до обработки а) и после обработки б) СЭМ изображения при WD=3,9 мм и увеличении 80 000х

На основании произведенных обработок СЭМ изображений наглядно показано, что подбор оптимальных параметров при измерении мазков крови позволяют получить более обширную и достоверную информацию.

Для данной модификации сканирующего электронного микроскопа при проведении экспериментов с образцами крови в виде сухих мазков на предметном стекле необходимо работать при низком ускоряющем напряжении 1 кВ без напыления проводящего слоя на образец с использованием нижнего детектора вторичных электронов, с активацией системы «Gentle Beam» и с выбором рабочего расстояния .

Таким образом, для определения подходов в выборе параметров в разработке метода дифференциальной диагностики различных видов гломерулонефритов с применением СЭМ на основе исследования морфологии эритроцитов крови на примере эксперимента с образцом крови пациента с ХМПГН необходимо обратить внимание на то, что существует зависимость качества изображения от четкого определения режима работы СЭМ с учетом большого влияния WD на него. Качество изображений влияет на проведение анализа морфологии эритроцитов, что в свою очередь будет определять подход в разработке метода дифференциальной диагностики видов гломерулонефритов с учетом того, что качество изображения влияет на определение вида и степени дисморфии эритроцитов, что является важной информацией в изучении заболевания, выявления особенностей его проявления на клеточном уровне.

1. Maksimov, G.V., Mamaeva, S.N., Antonov, S.R., Munkhalova Ya.A., Kononova, I.V., Sheikin, I.Yu. Measuring Erythrocyte Morphology by Electron Microscopy to Diagnose Hematuria //Measurement Techniques. June 2016. Volume 59 (3). pp 327–330.
2. Мамаева С. Н., Максимов Г. В., Мунхалова Я. А., Антонов С. Р., Дъяконов А. А., Винокуров П. В. Исследование эритроцитов крови с заболеваниями почек с синдромом гематурии с использованием растровой электронной и атомно-силовой микроскопии //Медицинская физика. 2017. № 1 (73), С.58–62.
3. Растровая электронная микроскопия для нанотехнологий. Методы и применение [Электронный ресурс] / под ред. У. Жу, Ж. Л. Уанга; пер. с англ. — Эл. изд. — М.: БИНОМ. Лабаратория знаний, 2013. — 582 с. (здесь тоже добавьте, пожалуйста литературу)
4. С. Н. Мамаева, Г. В. Максимов, С. Р. Антонов, В. А. Платонова, А. С. Гольдерова, И. В. Кононова, Я. А. Мунхалова, Н. А. Николаева, Т. М. Лебедева «Изучение действия низких температур на морфологию эритроцитов крови детей с гематурией методами оптической и электронной микроскопии» // Ж. Медицинская физика, № 3 (83), 2019 г. С.75–82.
5. Визильтер Ю. В., Желтов С. Ю., Князь В. А., Ходарев А. Н., Моржин А. В. Обработка и анализ цифровых изображений с примерами на LabVIEW IMAQ Vision. — М.: ДМК Пресс, 2007. — 464 с.

Основные термины (генерируются автоматически): рабочее расстояние, увеличение, ускоряющее напряжение, изображение, раз, режим работы, капиллярная кровь пациента, качество изображения, сканирующий электронный микроскоп, фокусное расстояние.

В статье автор пытается определить основы растровой электронной микроскопии и подготовку образцов.

Ключевые слова:



РЭМ, образец, микроскопия.

Большинство наноматериалов, например, углеродных нанотрубок, нанопроволок, наночастиц и наноструктурированных материалов, можно наблюдать в РЭМ непосредственно путем их фиксации на углеродной проводящей липкой ленте. Подготовка образцов достаточно проста. На некоторые непроводящие наноматериалы, особенно биоорганические, необходимо напылить слой металлического покрытия и подвергнуть их сложному процессу пробоподготовки. В данном разделе будет подробно обсуждаться процедура пробоподготовки биоорганических образцов.

Процедуры получения изображений биоорганических образцов в РЭМ высокого разрешения

Для обеспечения надлежащих рабочих характеристик электронной оптики в колонне РЭМ, пушке и камере образцов должен поддерживаться вакуум порядка 10–6 Торр. Исключением из этого правила являются рабочие условия в камере образцов РЭМ с естественной средой. Высоковакуумные условия являются враждебными для большинства форм жизни вследствие того, что живые клетки и биологические ткани содержат почти 80 % воды. Даже для небольших биомолекул требуется гидратная оболочка для того, чтобы они оставались в своем естественном состоянии. Подобная несовместимость жидких проб, таких как водные растворы, с вакуумной системой электронного микроскопа вынуждает переводить образец в твердое состояние, проводить осушение жидкостей, которые могли бы приводить к дегазации в высоком вакууме и загрязнении колонны микроскопа. Поэтому все жидкие образцы, загружаемые в камеру образцов РЭМ, должны быть осушены для того, чтобы получить стабильное изображение во вторичных электронах. Когда на РЭМ планируется проводить наноструктурные исследования биологических или сольватированных органических систем, необходимость удаления жидкостей значительно влияет на наблюдаемые структуры. Исключением среди условий пробоподготовки образцов путем их сушки является криофиксация и наблюдение при криогенных температурах (криоВРРЭМ — крио-РЭМ высокого разрешения, или cryo-HRSEM — cryo high resolution SEM), который сохраняет водный состав образца в твердом состоянии. В данном разделе мы рассмотрим необходимые этапы перевода биологического образца в твердое состояние (путем его сушки) с минимальными изменениями. Пробоподготовка должна быть достаточно мягкой, чтобы «существенные» детали структуры твердых компонентов в нанометровом масштабе можно было исследовать с помощью РЭМ. Во время испарения растворителя из жидкого образца в газовую атмосферу, как это происходит в случае сушки на воздухе, на поверхность образца действуют большие силы поверхностного натяжения. Это приводит к усыханию и сжатию структур в интервале размеров от 10–3 до 10–6 м, что делает невозможными РЭМ-исследование структур с размерами 1–10 нм. В процессе обычного высушивания на воздухе суспензии красных кровяных телец в воде силы поверхностного натяжения оказываются такими сильными, что разглаживают белые кровяные тельца до такой степени, что на их поверхности уже становится невозможным различить какие-либо структуры. Интересным исключением являются красные кровяные тельца, имеющие предельно гладкую поверхность, на которой не выявляется никаких структурных изменений в субмикронном интервале после сушки на воздухе. Однако молекулярные детали в интервале размеров от 1 нм до 10 нм будут сглажены силами поверхностного натяжения.

При использовании РЭМ в биомедицинских исследованиях электронный микроскоп служит в основном для регистрации характеристик топографии обработанной поверхности образца. Неорганические твердые вещества легко напыляются или фиксируются на столике образцов и могут непосредственно наблюдаться в РЭМ при высоких увеличениях, позволяющих увидеть в подробностях их наноструктуру. Более сложная стратегия иммобилизации молекулярных компонентов и структурных особенностей организмов, органов, тканей, клеток и биомолекул заключается в их химической фиксации в твердом состоянии с помощью химических соединений «кросс-линкеров», сшивающих биополимеры, с последующей обработкой их солями тяжелых металлов для повышения удельной массы компонентов. Биологические образцы сначала «фиксируются» с помощью глютаральдегида-диальдегида, который содержит пять атомов углерода. Когда такие молекулы буферизованы, биологическая проба либо поливается этим раствором, либо погружается в него, и он вступает в реакцию с N-концом аминокислот на соседних белках, высвобождая при этом молекулы 2H2 O и перекрестно сшивая пептидные цепочки. Таким образом, останавливается перемещение всех белковых компонентов клеток и тканей. Затем биологические образцы подвергаются «постфиксации» с помощью тетроксида осмия (OsO4), который, по-видимому, взаимодействует с ненасыщенными жирными кислотами, в то время как липиды служат для остановки вращения молекул относительно их связей и высвобождению 2H2 O. Поскольку OsO4 содержит самый тяжелый элемент, он служит для повышения электронной плотности и усиления рассеивающих свойств биологических мембран, которые в противном случае имеют низкий контраст при наблюдении в РЭМ. OsO4 также является красящим агентом, который взаимодействует сам с собой и с другими красящими веществами. Применение красящих агентов для растровой электронной микроскопии высокого разрешения не рекомендуется, поскольку они связывают дополнительные элементы с мембранами, так что при морфологическом разрешении 1–10 нм наблюдаемые структуры искусственно утолщаются и их размеры невозможно измерить с достаточной точностью. Методы окрашивания красиво работают при наблюдении клеточных органелл с промежуточным увеличением.

После фиксации водное содержимое образца перед сушкой замещается промежуточной жидкостью, обычно органическим растворителем, таким как этанол или ацетон. Для сушки на воздухе иногда применяют ряд растворителей, например, гексаметилдисилазан (ГМДС, или HMDS), Фреон 113, тетраметилсилан (ТМС, или TMS) и PELDRI II, поскольку они уменьшают величину сил поверхностного натяжения, вызывающих сжатие и усыхание клеток и деталей их поверхностной морфологии. Метод высушивания растворителя на воздухе применяют в надежде избежать более времязатратных методов. Эти растворители имеют очень низкое давление паров, и некоторые из них дают удовлетворительные результаты по фиксации белых кровяных телец при наблюдении в РЭМ на промежуточных увеличениях. Однако этот метод не годится для исследования наноморфологии в РЭМ с высоким разрешением. Поскольку процедура сушки удаляет гидратную оболочку с биоорганических молекул, наблюдается некоторое их сжатие в масштабе 1–10 нм. Наиболее общая схема обезвоживания заключается в использовании погружения образца в серию растворов этанола, либо ацетона с концентрациями 30 %, 50 %, 70 %, 90 % и 100 %, и нескольких промывок в чистом 100 %-м растворителе. Необходимо предпринимать меры предосторожности для того, чтобы не удалить слишком много объемной жидкости и не подвергнуть поверхность образца воздействию воздуха. Хотя, как известно, биологические клетки растягиваются при концентрациях ниже 70 % и сжимаются между 70 % и 100 %, изменение их формы можно контролировать с помощью бивалентных катионов, используемых в фиксирующих буферных растворах или промывочных ваннах. Превосходным методом обезвоживания является линейное градиентное дегидрирование, которое требует сменного устройства для медленного повышения концентрации промежуточной жидкости и служит для снижения осмотического удара и изменения формы образца.

В качестве обзора процедур пробоподготовки теперь рассмотрим методику получения изображения в ВРРЭМ биологически важных морфологических деталей размером 1–10 нм. В работе были представлены критерии в пользу и против метода сублимационной криосушки (СКС, или FD — freeze drying) по сравнению с методом сушки в критической точке (СКТ, или СPD — critical point drying), когда эти методы впервые были тщательно изучены в отношении сохранения деталей биологической структуры при морфологических исследованиях биологических образцов в РЭМ. В резюме этой работы сказано, что при фиксации образцов методом СКТ обычно применяются добавки веществ-криопротекторов (сахарозы и DMSO), которые способствуют уменьшению образования кристаллов льда, но при этом сами могут взаимодействовать с образцом. Фиксированные и обработанные криопротекторами образцы погружались в замороженном состоянии в криогенную жидкость (Фреон-22, пропан или этан) и затем помещались в вакуумную камеру, которая откачивалась до вакуума выше 10–3 Торр, и выдерживались в ней при температурах от –35 °C до –85 °C. При применении метода СКС наилучшим было использование в качестве криопротектора этанола, поскольку он сублимируется в вакууме вместе с образовавшимся льдом. Процедура СКС с последующей разморозкой, которая происходит в вакууме, занимает от нескольких часов до двух дней и приводит к более высокой потере объема образца, чем метод СКТ.

Метод СКТ, разработанный Андерсоном в 1951 г., является наиболее надежной и обычно применяемой процедурой сушки биологических образцов. В этом процессе образцы, которые были химически фиксированы и вода, в которых была замещена промежуточной жидкостью (этанолом или ацетоном), затем замещались переходной жидкостью типа жидкого диоксида углерода (CO2), которая подвергалась фазовому переходу в газообразное состояние в камере при повышенном давлении. Процесс СКТ происходит не без потери объема образца и линейного усыхания; однако в этом процессе отсутствуют силы поверхностного натяжения в критической точке (T = 31,1 °C, P = 1,073 \для CO2), определяемой температурой Т и давлением Р. Исследования, проведенные в 1980-х гг., показали, что линейный градиент дегидратации с последующими «процедурами тонкой обработки» для СКТ может существенно снижать усыхание образцов, которое наблюдалось в ранних экспериментах. Контроль расхода газа, выходящего из камеры установки сушки в процессе замещения промежуточной жидкости переходной жидкостью, и контроль температуры переходной жидкости от температуры замещения (4–20 °C) до температуры переходной жидкости (31,1 °C) заметно снижают линейное усыхание и сжимание образцов. Субклеточные структуры, такие как поверхностные микровпадины диаметром 100нм или изолированные везикулы, покрытые калатрином, почти сохраняют свои исходные форму и размер. Разнообразие биологических образцов, изучаемых в РЭМ, велико, и поэтому необходимые стадии обработки изолированных молекул с характерными размерами 1–10нм могут отличаться от тех, которые используются для получения изображений структур размерами 1–10нм в контексте их сложной биологической организации, например, таких структур, как органеллы, клетки, ткани и органы. Имеет смысл применять метод СКТ в качестве пробоподготовки для всех исследований массивных образцов в ВРРЭМ, однако для молекулярных изолятов лучше может работать метод СКС. После обсуждения методов нанесения металлических покрытий с нанометровой точностью для ВРРЭМ приводится протокол метода СКТ для получения изображений органелл размерами ~50–60нм, содержащих тонкие структуры с характерными размерами 1–10нм в контексте массивного образца (размерами больше 1 мм3), исследуемого с помощью ВРРЭМ, и дается сравнение полученных изображений с ПЭМ-изображениями фиксированных тонких срезов, залитых в смолу.

Биологические образцы по своей природе состоят из элементов с низким атомным весом, которые, естественно, при возбуждении их электронным пучком имеют низкий коэффициент эмиссии вторичных и отраженных электронов. Эти углеводородные образцы к тому же являются диэлектриками и часто заряжаются под пучком. С самого начала исследования биологических образцов в РЭМ использовался метод вакуумного напыления благородных металлов на образцы для придания им электропроводности. Такие металлы делают образцы проводящими, но тепло, излучаемое при напылении, приводит к тому, что горячие металлы внедряются в поверхность образца. Магнетронное осаждение таких металлов (золота, серебра, золота/палладия и платины) в атмосфере аргона уменьшает повреждение поверхности биоорганических образцов, но все же приводит к декорированию структуры большими зернами металлической пленки неоднородной толщины. Благородные металлы не подходят для пробоподготовки образцов для их исследования в ВРРЭМ вследствие большого размера зерен напыляемой пленки и большой подвижности: по мере того как зерна золота или других благородных металлов напыляются на образец, они стремятся мигрировать в направлении других зерен и сливаются друг с другом, наращивая пленку металла вблизи самых высоких морфологических деталей поверхности образца, приводя к ее «декорированию». Таким образом, некоторые структуры могут оказаться «перенапыленными», в то время как другие участки поверхности могут не иметь пленочного покрытия, что приводит к образованию островковых пленок. Кроме эффектов декорирования крупнозернистыми (2–6 нм) пленками металла наличие больших зерен благородных металлов увеличивает эффект рассеяния первичных электронов, приводя к повышенному коэффициенту эмиссии вторичных электронов и появлению вторичных электронов типа ВЭ-II и ВЭ-III. В противоположность эффекту декорированных металлических пленок, сверхмалые зерна металлов (Cr, Ti, Ta, Ir и W) имеют очень малую подвижность и моноатомную зернистость пленок. Эти металлы образуют не «декорации», а ровные «покрытия», поскольку атомные зерна остаются вблизи участков, на которых они были осаждены, образуя сверхтонкую сплошную пленку с малой «критической» толщиной, зачастую d1 нм. Малая зернистость этих металлов существенно повышает коэффициент эмиссии вторичных электронов первого типа ВЭ-I, обеспечивающих высокое разрешение, поскольку рассеяние первичных электронов в металлической пленке является ограниченным. Получающиеся изображения демонстрируют великолепное морфологическое разрешение с высокой точностью вплоть до нескольких нанометров, поскольку данная пленка дает ровное покрытие толщиной 1–2 нм по всему контуру образца.

1. O. C. Wells, Scanning Electron Microscopy, McGraw-Hill — New York, 1974.
2. S. Wischnitzer, Introduction to Electron Microscopy, Pergamon Press — New York, 1962.
3. M. E. Haine and V. E. Cosslett, The Electron Microscope, Spon — London, 1961.
4. A. N. Broers, in: SEM/1975, IIT Research Institute — Chicago, 1975.
5. J. Goldstein, D. Newbury, D. Joy, C. Lyman, P. Echlin, E. Lifshin, L. Sawyer, and J. Michael, Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, 3rd edn, Kluwer Academic/Plenum Publishers — New York, 2003.
6. C. W. Oatley, The Scanning Electron Microscope, Cambridge University Press — Cambridge, 1972.
7. J. I. Goldstein and H. Yakowitz, Practical Scanning Electron Microscopy, Plenum Press — New York, 1975.
8. Y. X. Chen, L. J. Campbell, and W. L. Zhou, J. Cryst. Growth — 2004.

Основные термины (генерируются автоматически): высокое разрешение, поверхностное натяжение, промежуточная жидкость, твердое состояние, металл, переходная жидкость, поверхность образца, гидратная оболочка, линейное усыхание, металлическая пленка.